离子交换分离纯化蛋白原理及应用

离子交换剂

基质主要有树脂、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和硅胶(HPLC)等

离子交换树脂一般只适合分离小分子物质如氨基酸等,不适合分离蛋白质等大分子物质,一方面是因为大分子不易进入树脂紧密交联结构的内部,另一方面因为交联聚苯乙烯骨架疏水性很强,用于蛋白质分离时,会出现疏水性的不可逆吸附。此外,离子交换树脂的机械强度较差,而且树脂的体积常随着溶剂离子强度的变化发生溶胀和收缩。

 根据交换基团的电荷性质进行分类:

阳离子交换树脂: 强酸型 含磺酸基团(R-SO3H)

                 中等酸型 含磷酸基团(-O-PO2H4)

                 弱酸型 含酚基、羧基

阴离子交换树脂: 强碱 含季胺基团[-N+(CH3)3]

                 弱碱 含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2

阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。

弱酸型—只能在碱性pH范围内使用           弱碱型—只能在酸性pH范围内使用

离子交换纤维素的种类很多,可分为阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维素两大类。由于这些材料是纤维状的,大部分活性基团分布在表面,所以,适合于分离蛋白质等生物大分子。阴离子交换纤维素—DEAE-纤维素,具二乙胺乙基,阳离子交换纤维素—CM-纤维素,具有羧甲基,分别是应用得最广泛的阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维素。另外,根据纤维素颗粒的物理结构不同,可分为“纤维型”和“微晶型”两大类。“微晶型”因颗粒细、比重大,能制成紧密的柱,交换容量大,分辨率高。

离子交换凝胶:离子交换葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶具有许多优点,分离大分子物质,不会引起被分离物质的变性戒失活,非特异性吸附很低;交换容量大(为离子交换纤维素的3-4 倍);容易制成微球型,因此装柱和层析时的流速都较易控制。它的缺点是随着洗脱液的离子强度和pH 的变化,床体积变化大,明显影响流速;另外,由于它的凝胶性质,有时会把大分子物质排阻在网络结构之外。

如:葡聚糖(Sephadex)、 聚丙烯酰胺(PAG)、琼脂糖(Sepharose)

平衡缓冲液:它的离子强度和pH的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合。

增强洗脱液与离子交换剂的结合力,降低分离物与离子交换剂的结合力

洗脱缓冲液:在离子交换层析中一般常用梯度洗脱,通常有改变离子强度和改变pH两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度,从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来;而改变pH的洗脱,对于阳离子交换剂一般是pH从低到高洗脱,阴离子交换剂一般是pH从高到低。由于pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响,故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱

离子交换分离纯化蛋白原理及应用

强酸性阳离子换剂H+的结合力比对Na+的小;HSP Sepharose FF

 Nacl、NaOH、NH4OH、NH4Cl洗脱   磷酸缓冲液平衡

弱酸性阳离子交换剂对H+的结合力远比对Na+的大;Na型  CM-纤维素

NAOH或HCL H+或Na+洗脱

强碱性阴离子交换剂对OH- 的结合力比对C1-的小得多;OH

弱碱性阴离子交换剂对OH- 的结合力比对Cl- 的大。Cl型DEAE-纤维素

Nacl、NaOH、乙酸铵(NH4Ac)、磷酸根(PO3-)洗脱  Tris-Hcl、磷酸盐缓冲液平衡。

阴离子交换剂碱性   碱性缓冲液   酸性蛋白   蛋白pI <pH 时   带负电

阳离子交换剂碱性   酸性缓冲液   碱性蛋白       pI > pH 时   带正电

DEAE-纤维  阴离子交换剂纯化分离酸性蛋白 碱性缓冲液  

CM纤维素   阳离子交换剂纯化分离碱性蛋白 酸性缓冲液  碱性越强,就越容易被阳离子交换剂吸附

蛋白在pH5~8稳定时,则应选择阴离子交换剂;蛋白在pH5以下稳定时,则可选择阳离子交换剂。

阴离子交换剂,pH8.6以下分离中性或酸性物质阳离子交换剂,一般pH>4条件下使用,

DEAE-纤维素吸附酶和蛋白质时常用pH为7~9,然后提高盐浓度或降低pH使之洗脱。

CM-纤维素常选在pH4.5~6.0左右吸附蛋白质,然后提高pH或盐浓度进行洗脱。

例:

用离子交换,那首先就要考虑是要阳离子还是阴离子,还有就是你的目的物的PH值

蛋白质是pI=6.27 阴离子交换,用pH8.0-9.0的缓冲液  

首先利用缓冲液PH值把目的蛋白给结合到柱子上,然后用合适的盐离子洗脱下来。

阴离子交换柱:上样缓冲液20mM Tris-HCl,用0—0.5M NaCl梯度洗脱,流速约2ml/min。

注意:首先是蛋白的等电点是多少选择pH值,挂柱时pH尽量不要超过pI值的2个点。Nacl的浓度可以设梯度,平衡时用0.1mol之后可以选择0.3 0.6 1.2mol的浓度,一般0.6 或1.2就可以洗脱下目的峰。然后蛋白上柱变性了是洗不下来的,只能用1molNaOH或8mol脲洗,再生柱子,还有些脂质洗不下来,需要用30%异丙醇洗柱再生。

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